Tutkimusmenetelmät

Laboratorio tutkii näytteet perinteisin viljelymenetelmin, tunnistukset tehdään yleensä massaspektrometrisesti MALDI-Tof -laitteella. Joskus kanta lähetetään tunnistettavaksi 16S rRNA -sekvensoinnilla, mikäli tunnistus tavanomaisin menetelmin ei onnistu. Salmonella-tutkimus perustuu ISO-standardiin 6579.

Herkkyysmääritysmenetelmämme perustuu CLSI:n standardeihin ja Ruokaviraston herkkyysmenetelmäohjeisiin. Herkkyysmääritykset tehdään yleensä kiekkodiffuusiolla, osa tutkitaan E-testimenetelmällä. Tutkittavat mikrobilääkkeet valitaan lajitunnistuksen perusteella. Jonkin verran mikrobilääkepaneeliin vaikuttaa myös se, mistä bakteeri on eristetty. Lääkeaineita, joille eristetty bakteerilaji on luontaisesti resistentti, ei testata.

Laaduntarkkailu

Noudatamme laboratoriossa kirjallista laatujärjestelmää, joka perustuu standardiin ISO 17025.

Varmistamme tulosten luotettavuutta osallistumalla säännöllisesti laboratorioiden välisiin vertailututkimuksiin. Sisäistä laadunvarmistusta tehdään säännöllisesti ATCC-kontrollikannoilla. Näin voimme varmistua siitä, että käytettävät kasvatusalustat ja herkkyysmäärityskiekot toimivat toivotulla tavalla ja että lajitunnistuksemme on tarkkaa.

Näytteestä tehdään semikvantitatiivinen viljely, josta arvioidaan kasvun määrä, sekä tehdään bakteerien tunnistus ja herkkyysmääritys.

Näytteenotto-ohjeet

Menetelmä

Näytteet viljellään semikvantitatiivisesti nonselektiiviselle maljalle ja inkuboidaan 1-2 vuorokautta. Rikastusviljelyssä virtsaa laitetaan myös rikasteeseen.

Vastaus

Alustava vastaus annetaan viljelyä seuraavana arkipäivänä. Herkkyysmääritystulokset saadaan useimmiten tätä seuraavana arkipäivänä. Maljoja, joissa ei ole kasvua, kasvatetaan kaksi vuorokautta ennen kuin lopullinen vastaus annetaan. Mikäli näytteestä on pyydetty rikastusviljely, näytteitä kasvatetaan seitsemän vuorokautta ennen negatiivisen tuloksen lopullista vastaamista.

Tulkinta

Bakteeriviljelyn tulokset tulee aina suhteuttaa potilaan oireisiin ja virtsan sakan tulehdusmuutoksiin. Mikäli potilaalla ei ole kliinisiä oireita eikä virtsan sakassa ole tulehdusmuutoksia, voi kyseessä olla ns. oireeton bakteriuria. Oireetonta bakteriuriaa ei yleensä tule hoitaa.

Kystosenteesinäyte: Vähäinenkin kasvu vastataan merkittävänä.

Katetrinäyte: Merkittävä kasvu >10E3 cfu/ml, jos näyte otettu katetroimisen yhteydessä.

Keskivirtsanäyte: Merkittävä kasvu >10E4-5 cfu/ml. Vähäisempi kasvu voidaan tulkita merkittäväksi, mikäli kyseessä on puhdas kasvu ja mikäli virtsa on ollut rakossa vain vähän aikaa, virtsanäytteen sakassa on selviä tulehdusmuutoksia ja potilaalla on kliinisiä oireita. Mikäli keskivirtsanäytteessä kasvaa ≥ 3 bakteerilajia, tulos viittaa kontaminaatioon eikä jatkotutkimuksia tehdä.

Virhelähteet

  • Liian vähäinen näytemäärä kuljetusputkessa voi estää bakteerien kasvun viljelyssä.
  • Vapaasti lasketuissa näytteissä runsas kontaminaatio voi aiheuttaa väärän tulkinnan.

Pintamärkänäytteistä määritetään patogeeniset aerobit bakteerit. Näytetyyppejä ovat esimerkiksi haavaerite pinnallisista haavoista, korvaerite, ihottumaleesion erite (esim. furunkkeli) ja silmäerite. Lähetteessä tulee mainita, mistä näyte on otettu. Näyte otetaan näytteenottotikulla, jossa on mukana geelimäinen kuljetuselatusaine.

Näytteenotto-ohjeet

Menetelmä

Pintamärkänäytteet viljellään useimmiten kahdelle tai kolmelle eri bakteerimaljalle, iho- tai korvanäyte myös hiivamaljalle.

Vastaus

Alustava vastaus saadaan viljelypäivän jälkeisenä arkipäivänä. Yleisimmät taudinaiheuttajat kasvavat yhdessä vuorokaudessa, mutta etenkin hyvin pienten bakteerimäärien ja heikommin kasvavien lajien ja hiivojen suhteen kasvu voi näkyä vasta 2-3 vuorokauden kuluttua. Pintamärkänäytteitä kasvatetaan tavallisesti vähintään 4 vuorokautta ennen lopullisen vastauksen antamista.

Virhelähteet

  • Yleisin virhelähde pintamärkäviljelyissä on kontaminoiva bakteerifloora. Pahimmassa tapauksessa nopeakasvuinen kontaminanttibakteeri voi peittää alleen varsinaisen taudinaiheuttajan. Tämän takia näytealueen puhdistus kaikista eritteistä on erittäin tärkeää.

  • Ennen näytteenottoa aloitettu mikrobilääkehoito voi estää bakteerien kasvun.

Syvämärkänäytteistä tehdään aerobi- ja anaerobiviljely. Syvämärkänäytteitä ovat syvistä haavaonteloista otetut eritteet, punktionäytteet (mm. absessi, nivelneste, peritoneaalineste, pleuraneste, selkäydinneste jne.) ja elinten biopsianäytteet lukuun ottamatta ihobiopsioita. Lähetteessä tulee mainita näytetyyppi ja näytteenottokohta. Korvanäytteistä syvämärkäviljely kannattaa pyytää vain, jos näyte on saatu keskikorvaontelosta (bulla).

Näytteenotto-ohjeet

Menetelmä

Syvämärkänäytteet viljellään useimmiten vähintään kahdelle eri aerobi- ja yhdelle tai kahdelle anaerobimaljalle. Viljeltävä maljavalikoima riippuu mm. näytteenottoalueesta ja leesion tyypistä. Lisäksi lähes kaikista syvämärkäviljelyistä tehdään rikastusviljely rikasteliemessä.

Vastaus

Aerobibakteerit vastataan kuten pintamärkäviljelyssä. Anaerobibakteerien suhteen vastaus kestää pitempään, sillä anaerobilajit kasvavat hitaammin.

Negatiivisia näytteitä kasvatetaan 7 vuorokautta ennen lopullista vastausta.

Virhelähteet

  • Yleisin virhelähde syvämärkäviljelyissä on kontaminoiva bakteerifloora. Nopeakasvuinen kontaminantti voi peittää alleen varsinaisen taudinaiheuttajan tai esimerkiksi ihon pinnalta peräisin oleva bakteeri voidaan katsoa merkittäväksi. Tämän johdosta näytealueen puhdistus kaikista eritteistä on erittäin tärkeää.

  • Ennen näytteenottoa aloitettu mikrobilääkehoito voi estää bakteerien kasvun.

Moniresistenttien bakteerien varalta otettavien seulontaviljelyiden tarkoitus on tunnistaa näitä bakteereja kantavat eläimet mahdollisimman aikaisessa vaiheessa. Nämä bakteerit (MRSP, MRSA, ESBL) voivat aiheuttaa epidemioita eläinsairaaloissa ja eläinlääkäriasemilla.  Riskipotilaiden tunnistaminen ja seulonta on tärkeää hallittaessa hoitoperäisiä infektioita aiheuttavia moniresistenttejä bakteereita, jotka ovat erittäin herkästi leviäviä.  Seulontaviljelyt auttavat myös epidemiatilanteissa mitoittamaan torjunta-toimien laajuutta sekä arvioimaan niiden onnistumista.

Seulonnat kannattaa kohdistaa riskipotilaisiin (vastikään ulkomailta tuodut lemmikkieläimet ja hevoset, aiemmin sairaalassa tai eläinlääkäriasemilla hoidetut potilaat, joilla on esim. leikkaustoimenpiteeseen tai muuhun toimenpiteeseen liittyvä infektio, krooniset iho- ja korvainfektiopotilaat, joilla useita mikrobilääkityksiä jne.).

Näytteenotto-ohjeet

Menetelmä

MRSA- ja MRSP-seulonta

MRSA/MRSP-viljelypyynnöstä tutkitaan vain MRSA/MRSP-bakteerin esiintyminen rikastusmenetelmällä; siitä ei siis etsitä varsinaisia infektion aiheuttajia. Jos myös infektion aiheuttaja(t) halutaan esiin, tulee lisäksi ottaa näyte märkänäyteohjeiden (pintamärkä tai syvämärkä) mukaisesti.  Yleensä märkänäyteviljelyssäkin MRSA/MRSP tulee esiin, jos se on valtalajina.

MRSP/MRSA-seulontojen suhteen tehdään ensin vuorokauden kestävä esirikastus selektiivisessä rikasteliemessä. Tämän jälkeen liemi viljellään MRSA/MRSP-selektiiviselle maljalle jota kasvatetaan 1-2 vuorokautta. Epäilyttävät pesäkkeet tunnistetaan. Metisilliiniresistenssin seulontaan käytetään ensisijaisesti herkkyyttä oksasilliinille.

ESBL-seulonta

Laajakirjoisia betalaktamaaseja tuottavat gramnegatiiviset bakteerit (lähinnä E. coli ja Klebsiella sp.) tuottavat entsyymejä, jotka hajottavat mm. kolmannen polven kefalosporiineja.

ESBL-seulonnassa näyte viljellään suoraan ESBL-selektiiviselle maljalle. Näytteitä kasvatetaan 1-2 vuorokautta. Epäilyttävät pesäkkeet tunnistetaan. ESBL-tuoton toteamiseen käytetään kiekkoherkkyysmenetelmää, jossa on mukana muun muassa kefpodoksiimi, keftatsidiini, kefotaksiimi sekä näiden betalaktamaasi-inhibiittorilla potentoidut vastaavuudet.

Vastaus

Koska MRSA-/MRSP-seulonta tehdään rikastusmenetelmällä, alustava vastaus saadaan vasta kahden vuorokauden kuluttua viljelystä. Joskus varmistus voi viedä useamman vuorokauden, mutta mikäli epäillään, että kyseessä on MRSA tai MRSP, siitä laitetaan maininta alustavaan vastaukseen, jotta klinikalla voidaan tarvittaessa ryhtyä varotoimenpiteisiin. Silloin tällöin vastaan tulee kantoja, jotka ovat seulontarajan tuntumassa. Nämä kannat joudutaan usein varmentamaa MRSP/MRSA:ksi toteamalla mecA- tai mecC-geeni niiden perimästä PCR-menetelmällä. Tällöin vastauksessa kestää kauemmin.

MRSP-/MRSA- ja ESBL-bakteereista vastataan laji sekä löydöksen laaja herkkyysprofiili. Tässä on mukana herkkyydet kaikille Suomessa kyseiselle eläinlajille sallituista lääkeaineista,  joille on olemassa tulkintakriteerit kansainvälisissä herkkyysmääritysstandardeissa.

Tulkinta

MRSP-kannat leviävät helposti eläinlääkäriasemilla ja eläinsairaaloissa. Ne voivat aiheuttaa myös epidemioita. Tämän vuoksi MRSP-positiivisia eläimiä kannattaa käsitellä eläinlääkäriasemilla/sairaaloissa kosketuseristyksessä. Mikäli potilas joutuu hoitoon eläinsairaalaan, tulisi löydöksestä ilmoittaa lähetteessä. Normaaliolosuhteissa kotiympäristössä MRSP-bakteereista ei ole haittaa. MRSP-positiivisen eläimen kanssa voi liikkua ja harrastaa normaalisti infektion parannuttua. Suosittelemme omistajia käsittelemään kaikkia eläinten haavoja aina käsineet kädessä ja hyvää käsihygieniaa (käsienpesu) noudattaen.

ESBL- ja MRSA-bakteerit leviävät helposti eläinlääkäriasemilla ja eläinsairaaloissa. Ne voivat aiheuttaa myös epidemioita. Suosittelemme käsittelemään potilasta kosketuseristyksessä. Mikäli eläin hakeutuu muulle eläinlääkäriasemalle tai eläinsairaalaan, tulee löydöksestä ehdottomasti ilmoittaa hoitohenkilökunnalle. Myös mikäli koiran kanssa päivittäin tekemisissä olevat ihmiset joutuvat hakeutumaan terveydenhoitoalan yksikköön, tulee löydöksestä ilmoittaa hoitohenkilökunnalle, jotta yksikkö voi päättää mahdollisesta näytteenotosta ja/tai eristystoimenpiteistä.

Virhelähteet

  • Ennen näytteenottoa aloitettu mikrobilääkehoito voi estää bakteerien kasvun.

Hengitystienäytteitä ovat muun muassa BAL- ja trakealimanäytteet sekä pääntaudin seulontanäytteet. Lisäksi laboratoriossa tutkitaan muita hengitystienäytteitä, esimerkiksi ilmapussi- ja sierainlimanäytteitä. Lähetteessä tulee mainita, mikä erite on kyseessä.

Näytteenotto-ohjeet

Menetelmä

Jos näyte toimitetaan nesteenä (esim. BAL-huuhde), tehdään näytteestä kvantitatiivinen viljely. Mikäli näytemateriaali on erityisen paksua, voidaan se viljellä myös laimennettuna rinnan laimentamattoman kanssa. Jos näyte on hyvin kirkasta ja juoksevaa, viljellään näyte fuugauksen jälkeen.

Näyte viljellään non-selektiivisille ja selektiivisille maljoille eläinlajin ja näytetyypin mukaan. Jos kyseessä on hevosen kuljetuskuume tai aspiraatioepäily, viljellään näytteestä myös anaerobimaljat.

Vastaus

Hengitystienäytemaljoja kasvatetaan normaalisti neljä vuorokautta.

Kvantitatiivisissa viljelyissä kasvun määrä ilmoitetaan yksikössä pmy/ml. Näytteestä pyritään erottamaan mahdollinen valtalaji tai -lajit.

Tulkinta

Hengitystienäytteiden tulkinta on haastavaa. Etenkin ylähengitystienäytteissä normaaliflooran määrä on runsas ja eläinlajista riippuen lajien merkittävyyden arviointi on epävarmaa.

Viljelyn tulos tulisi suhteuttaa sytologisiin löydöksiin, kliinisiin oireisiin ja muihin laboratorioparametreihin.

Hevosilla kaksoiskatetrin kautta otetut BAL-näytteet antavat usein luotettavimman tuloksen, joskin näissäkin näytteissä on vaarana näytteen kontaminoituminen ylähengitystieflooralla ja ympäristöbakteereilla.

Virhelähteet

  • Näyte voi kontaminoitua ylähengitysteiden mikrobistolla, mikäli potilas yskii voimakkaasti näytteenoton aikana.
  • Ennen näytteenottoa aloitettu mikrobilääkehoito voi estää bakteerien kasvun.

Eläimellä tulisi olla ripulioireita ennen kuin ulosteen bakteerinäytettä kannattaa tutkia. Hyvä nyrkkisääntö on, että näytteen tulisi noudattaa astian muotoa. Poikkeuksena ovat salmonellakantajuuden varalta tutkittavat eläimet.

Näytteenotto-ohjeet

Tutkimusvalikoima

Salmonellaviljely

Salmonella-menetelmä perustuu ISO-standardiin 6579.  Tutkimusvalikoimassa on sekä yksittäinen salmonellaviljelynäyte että sarjanäyte, joka sisältää 2-3 peräkkäisinä päivinä otettua näytettä. Lähetteessä tulee mainita, onko potilaalla oireita vai onko kysymyksessä salmonellakantajuuden selvittäminen. Kantajuuden tutkimiseen tulisi aina ottaa sarjanäyte.

Koirien ja kissojen ripulipaketti

Koirille ja kissoille on kaksi eri ripulipakettia. Ripulipaketti 1:ssä tutkitaan Salmonella, kampylobakteerit ja patogeeniset Yersinia-lajit (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Ripulipaketti 2:ssa tutkitaan lisäksi Clostridium perfringens ja toksiinia tuottava Clostridium difficile.

Hevosten ripulipaketti

Hevosten näytteistä tehdään salmonellaviljely ja anaerobiviljely klostridien (C. perfringens ja toksiinia tuottava C. difficile) varalta.

Vastaus

Kaikkien tutkimukseen kuuluvien bakteerien osalta negatiivisen näytteen vastaus kestää 4-5 vuorokautta. Mikäli näytteessä esiintyy jotakin tutkimukseen kuuluvaa bakteeria, alustava vastaus voidaan saada 2-3 vuorokaudessa.

Tulkinta

Tulosten tulkinta on hankalaa. Esimerkiksi kampylobakteereita (etenkin C. upsaliensis) ja klostrideja esiintyy myös terveillä koirilla, joten näiden merkitys taudinaiheuttajina on epäselvä, vaikkakin toksiineja tuottavia klostridikantoja pidetään joissain tutkimuksissa merkityksellisinä.

Virhelähteet

  • Ympäristöperäiset kontaminantit voivat aiheuttaa virheellisen positiivisen tuloksen tutkittavien bakteerien suhteen. Tämän johdosta näyte tulisi saada tuoreena peräsuolesta tai tuoreen ulostekasan päältä/keskeltä.

  • Ennen näytteenottoa aloitettu mikrobilääkehoito voi estää bakteerien kasvun.

Veriviljelynäytteestä tehdään rikastusviljely aerobi- ja anaerobibakteerien varalta. Näyte otetaan joko keskuslaskimosta tai perifeerisestä suonesta. Tutkimusvalikoimassa on yksittäinen veriviljely tai ns. sarjanäyte (2-3 pulloparia samasta potilaasta).

Näytteenotto-ohjeet

Menetelmä

Veriviljelypullot asetetaan veriviljelylaitteeseen joka seuraa automaattisesti veriviljelypullon pohjassa olevan indikaattoriosan värimuutosta. Laite mittaa indikaattorin värimuutoksen 10 minuutin välein ja piirtää samalla kasvusta käyrän tietokoneen muistiin. Positiivisista pulloista tehdään aerobi- ja anaerobiviljely sekä gramvärjäys, jonka perusteella annetaan alustava vastaus.

Vastaus

Alustava tulos voi tulla jopa saman päivän aikana, jos näyte on tullut laboratorioon aamulla. Todellisessa sepsiksessä veriviljelykone hälyttää usein jo 4-5 tunnin kuluttua seurannan aloittamisesta. Aika vaihtelee toki bakteerilajin ja -määrän mukaan. Positiivisista näytteistä alustava vastaus on usein saatavilla jo seuraavana päivänä, mutta tunnistukseen ja herkkyysmäärityksen tekemiseen kuluu pidempi aika riippuen lajeista. Lopullinen negatiivinen tulos saadaan 7 vrk kuluttua.

Virhelähteet

  • Jos näytteen määrä jää vähäiseksi, tuloksena voi olla väärä negatiivinen.

  • Mikäli näytteenoton yhteydessä on tapahtunut kontaminaatio, tulos on usein väärä positiivinen. Bakteerikasvua tulee tällöin usein hitaasti, esimerkiksi vasta 4-5 vuorokauden kuluttua. Jos laboratoriossa herää epäily - yleensä näytteessä kasvavan bakteerilajin perusteella - että kyseessä saattaa olla näytteenoton tai -käsittelyn yhteydessä tapahtunut kontaminaatio, siitä mainitaan laboratoriovastauksessa.

  • Väärä negatiivinen tulos voi johtua mm. eläimen saamasta mikrobilääkityksestä. Positiivisen tuloksen saamiseksi näytteessä on oltava elinkelpoisia bakteereita. On myös mahdollista, että näytteenottohetkellä potilaan verenkierrossa ei ollut bakteereita. Tästä syystä on suositeltavaa ottaa veriviljelynäytteet potilaan kuumepiikin aikana ja mielellään 2-3 näytteen sarjoissa.

Näytteen mukana voi lähettää objektilasin gramvärjäykseen. Gramvärjäykselle tehdään oma lähete.

Ohjeet lasin tekoon

Menetelmä

Laboratoriossa lasi värjätään suoraan gramvärjäyslaitteessa.

Vastaus

Vastauksen saa viimeistään seuraavana arkipäivänä, useimmiten jo parin tunnin sisällä näytteen saapumisesta laboratorioon. Vastaus annetaan bakteerin gramvärjäytyvyyden ja solumorfologian, sekä mahdollisten muiden ominaisuuksien, kuten itiöiden olemassaolon perusteella.

Tulkinta

Tulosta tulkittaessa on otettava huomioon, että näytteestä tehty suora gramvärjäys ei ole kovinkaan herkkä menetelmä bakteerien löytämiseksi. Bakteereita tulee olla näytteessä >104/ml, jotta ne näkyvät gramvärjäyksessä.

Virhelähteet

  • Liian paksu levite tekee näytteestä tutkimuskelvottomaan. Tästä syystä suosittelemme lähettämään useamman levitteen.
  • Näytteen liian vähäinen määrä.
  • Tulkintaa hankaloittaa näytteen runsas proteiinipitoisuus.

Nivelnesteelle ja hengitystienäytteelle (trakealima/BAL) voi pyytää myös soluerittelyn. Näytelasit tulee valmistaa klinikalla. Jos halutaan soluerottelu esimerkiksi eri nivelille, tulee jokaiselle näytteenottokohdalle tehdä oma lähete.

Ohje lasin tekoon

Menetelmä

Laseille tehdään laboratoriossa MGG-värjäys, joka mahdollistaa solujen erottamisen toisistaan.

Vastaus

Hengitystienäytteelle vastataan neutrofiilit, eosinofiilit, basofiilit, lymfosyytit, makrofagit ja epiteelisolut.

Nivelnesteelle vastataan mononukleaariset solut ja neutrofiilit.

Virhelähteet

  • Liian vähäinen näytemäärä lasilla.
  • Rikkoutuneet solut.

Milloin hygieniaviljelyitä kannattaa ottaa?

Ota ennen näytteenottoa yhteyttä laboratorioon. Näytteitä tulisi ottaa vain tilanteessa, jossa yksikössä on jokin infektio-ongelma ja jota ei muilla toimenpiteillä saada hallintaan. Näytteet tutkitaan erityisesti moniresistenttien bakteerien varalta (MRSP, MRSA, ESBL, AmpC, CPE). Lisäksi tutkitaan pintojen yleistä hygieenisyyttä kokonaisbakteerimäärää arvioimalla.

Yhteen lähetteeseen voi sisällyttää kolme näytteenottokohtaa (= näytteenottotikkua) samasta kohteesta. Valitse lähetteeseen tutkimusryhmä "Muut tutkimukset", ja sen alta "Hygieniaviljelyt, pintanäyte (MRSA/P/ESBL, karkeasti bakt. määrä ja lajit)".

Näytteenotto-ohjeet

Menetelmä

Näytteet viljellään sekä non-selektiivisille (kasvun määrän määritys) että selektiivisille (MRSA/MRSP, ESBL) maljoille.

Vastaus

Kasvuston määrää arvioidaan non-selektiiviseltä maljalta seuraavasti:

  • 0 pesäkettä: ei kasvua
  • 1-9 pesäkettä: vähäinen kasvu
  • 10–20 pesäkettä: kohtalainen kasvu 
  • > 20 pesäkettä: runsas kasvu

Tämän lisäksi luetellaan yleisimmät bakteerilajit. Jos näytteessä esiintyy yllä lueteltuja moniresistenttejä bakteereita, ne ilmoitetaan kasvun määrästä riippumatta.

Tulkinta

Arvio hygieniatasosta on suuntaa antava ja pitää suhteuttaa mm. näytteenottokohtaan. Lattialla voi sallia kohtalaiseen mikrobitason ja toisaalta taas kosteilla pinnoilla jopa runsaan tason. Pinnan puhtausvaatimustaso riippuu siitä, onko kyseessä kosketuspinta ja/tai pinta, jossa potilas on suorassa kontaktissa. ESBL tai MRSA/P -bakteereja ympäristöstä ei tulisi löytyä.

Myös siivouksen ajankohta on huomioitava arvioitaessa, vaaditaanko toimenpiteitä pinnan puhdistuksen suhteen (onko esim. näyte siivotusta pinnasta vs. siivoamattomalta pinnalta).